Analisis Perbedaan Kolom pada Deteksi Karbohidrat Susu Fermentasi dengan Metode HPLC
(Analysis of Column Deferences in Determination of Fermented Milk Carbohydrates by HPLC)
A.N. Al-Baarri, dan T.W. Murti.
Animal Science Diponegoro University, Semarang
Abstract
This research was conducted to analyse the effect of different types of column in High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method on determination of carbohidrates composition of fermented milk i.e. glucose, galactose, lactose. This research used three milk products : yakult, yogurt, kefir, and three tipes of column i.e. “Aminex HPX-87H” column, CLC ODS column, and Microporosyl Carbohydrates column. Yakult was produce by inoculation of Lactobacillus casei in skim milk. Yogurt was produce by fermentation of Streptococcus thermophillus and Lactobacillus bulgaricus in skim milk, and kefir was produce by Streptococcus thermophillus, Lactobacillus bulgaricus and yeast inoculation in skim milk. All of samples were incubated for 6 hours. Samples was prepared as Mannheim method for carbohydrate analysis. Data were analysed by completely randomized design factorial with a 3x3 factorial. The result indicated that determination of carbohydrates composition on yakult, yogurt, kefir were not influenced by different kinds of column but the highest carbohydrates level was reached by “Aminex HPX-87H” column.
Keyword: Chromatography, Carbohydrates, Fermented Milk
PENDAHULUAN
Penggunaan HPLC dapat digunakan untuk menganalisa berbagai macam kandungan yang komplek dalam suatu bahan menurut jenis kolom yang digunakan. Senyawa komplek, misalnya karbohidrat, yang masuk kedalam HPLC, terlebih dahulu akan masuk kedalam kolom yang merupakan bagian utama HPLC. Di dalam kolom, senyawa komplek tersebut akan dipisah-pisah menurut ikatan kimianya terutama rantai karbonnya. Senyawa yang mempunyai rantai karbon panjang, akan terdeteksi paling akhir. Didalam kolom, senyawa komplek tersebut dipanaskan menurut ketentuan penggunaan kolom (Biorad, 1998)
Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performan kromatogram (Supelco, 1992). Jenis kolom yang dapat digunakan untuk menganalisis komposisi karbohidrat di dalam susu, diantaranya adalah ““Aminex HPX-87H””, “Waters Microporosyl Carbohidrate”, dan “CLC ODS”. Jenis kolom yang dipakai harus sesuai dengan kondisi optimal dan juga sesuai dengan tujuan analisis.(Biorad, 1998).
Sebelum sampel diinjeksikan kedalam perangkat HPLC, terlebih dahulu dilakukan penyaringan dengan menggunakan “filter milipore” dengan diameter 0,45 mm. Namun untuk tujuan tertentu, misalnya untuk sterilisasi dari bakteri, mungkin saja dilakukan penyaringan dengan menggunakan “filter milipore” dengan diameter 0,22 mm. Penyimpanan sampel untuk jangka waktu yang lama, sebaiknya menggunakan milipore dengan diameter 0,22 mm agar kontaminasi bakteri dapat diminimalisir (Mannheim, 1997).
Perlakuan lain pada sampel adalah dengan menggetarkan sampel pada “ultrasonic beam” agar terbebas dari gelembung udara. Selanjutnya setelah melakukan tahap ini, dilakukan pengeluaran gas (“degas”) dengan menarik gelembung udara dari dalam media dengan menggunakan peralatan pompa vakum (Mannheim, 1997)
Kemampuan kolom Aminex dalam mendeteksi karbohidrat susu maupun susu fermentasi, adalah baik. Hal ini sesuai dengan yang dilaksanakan Toba et al. (1982), yang menggunakan kolom jenis “Aminex HPX” untuk mendeteksi karbohidrat dalam yogurt. Karbohidrat yang terdeteksi pada kromatogram adalah sukrosa, laktosa, glukosa, galaktosa dan fruktosa.
Pirisino (1983) juga melakukan analisis deteksi karbohidrat pada susu dengan kolom “Aminex HPX-87C”. Jenis karbohidrat yang terdeteksi adalah laktosa, glukosa, dan galaktosa.
Kolom “Water Microporosyl Carbohydrate” dan kolom “CLC ODS”, dapat mendeteksi karbohidrat susu fermentasi namun tidak dapat memisahkan karbohidrat disakarida yang terdeteksi. Namun puncak grafik yang bersatu ini masih dapat dipisahkan dengan perhitungan khusus. Analisis kromatografi tersebut dijalankan dengan menggunakan eluen Asetonitril, H2O dan SAM (Silica Amine Modifier) II dengan perbandingan berturut-turut 75 : 25 ; 0,1 persen w/v. (Mannheim, 1987)
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan yang dihasilkan pada analisis karbohidrat tiga jenis susu fermentasi yaitu yakult, yogurt, kefir dengan menggunakan metode HPLC dengan jenis kolom yang berbeda-beda.
MATERI DAN METODE
Materi
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu segar, starter yakult, yogurt, kefir, serta bahan untuk preparasi sampel yaitu TCA, NaOH, Aquades, Aquabides. Alat yang digunakan untuk penelitian meliputi perangkat HPLC, waterbath, lemari es, filter milipore 0,45 mm.
Khusus untuk kromatografi, dugunakan alat-alat yaitu “syringe injector”, “column oven”, “Communication Bus Module”, “Load Chromatograph” (LC), “Refractive Index Detector”, Pencetak data.
Fase bergerak kolom Aminex adalah H2SO4 0,005 M, sedangkan untuk kolom “Water Microporosyl Carbohydrate” dan kolom “CLC ODS”, digunakan methanol 70% sebagai fase geraknnya.
Metode
Cara kerja penelitian ini dibagi dalam tiga tahap, yaitu:
Tahap I. Tahap ini adalah tahap pembuatan sampel dengan cara menginokulasi susu skim dengan berbagai macam baktreri. Yakult dibuat dengan cara menginokulasikan bakteri Lactobacillus casei ke dalam susu skim. Yogurt dibuat dengan menginokulasi bakteri Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus ke dalam susu skim kemudian kefir dibuat dengan cara menginokulasi bakteri Streptococcus thermophillus, Lactobacillus bulgaricus dan yeast. Setelah proses inokulasi selesai, susu kemudian diinkubasi di dalam inkubator selama 6 jam pada suhu 39°C.
Tahap II. Tahap ini dimulai dengan mempersiapkan sampel yang akan diuji. Yakult, yogurt, dan kefir dipreparasikan agar bisa diinjeksikan ke dalam perangkat HPLC. Langkah kerja preparasi sampel dapat dilihat pada gambar 1.
Sampel dimasukkan ke dalam venojek yang terlebih dahulu telah disterilkan. Kemudian ditutup rapat-rapat dan langsung dianalisis dengan menggunakan HPLC.
Tahap III. Tahap ini adalah penginjeksian sampel ke dalam perangkat HPLC. Sampel diuji dengan HPLC dengan menggunakan 3 jenis kolom yang berbeda, yaitu kolom ““Aminex HPX-87H””, kolom “Waters Microporosyl Carbohydrate”, kolom “CLC ODS”.
Semua data yang didapat kemudian dianalisis secara kuantitatif dengan membandingkan hasil kromatogram dari 3 jenis kolom yang berbeda dengan menggunakan uji “Completly Randomized Design” pola faktorial 3 x 3.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Data analisis karbohidrat yakult dengan menggunakan kolom ““Aminex HPX-87H””, kolom “Waters Microporosyl Carbohydrate”, kolom “CLC ODS” dapat dilihat pada Tabel 1. Data pada Tabel 1 menunjukkan adanya perbedaan yang tidak nyata pada komposisi laktosa, glukosa dan galaktosa dengan menggunakan 3 jenis kolom yang berbeda. Walaupun data pada Tabel 1 menunjukkan adanya perbedaan yang tidak nyata, namun data yang tertinggi dicapai pada kolom dengan jenis “Aminex HPX-87H”. Hal ini menunjukkan bahwa kolom jenis “Aminex HPX-87H” adalah jenis kolom yang mampu mendeteksi kadar karbohidrat dengan lebih peka dibanding dengan jenis kolom lainnya (Tabel 1).
Penggunaan kolom Aminex untuk penentuan kadar karbohidrat adalah sangat tepat. Hal ini dikarenakan bahwa kolom Aminex merupakan kolom yang mampu mendeteksi dengan lebih peka dan mampu mendeteksi laktosa, glukosa, dan galaktosa secara terpisah (Biorad, 1998)
Analisis karbohidrat dengan menggunakan perangkat kromatografi yang menggunakan jenis kolom berlainan, dapat menunjukkan hasil yang berbeda-beda. Hal ini dapat terjadi sebagai akibat adanya perbedaan kemampuan pemisahan antar masing-masing jenis kolom (Supelco, 1991). Selanjutnya dijelaskan pula bahwa penentuan suatu senyawa akan terdeteksi dengan lebih baik jika menggunakan kolom yang sesuai. Ketiga kolom yang digunakan pada penelitian telah sesuai dengan tujuan pembuatan kolom yaitu diantaranya untuk mendeteksi adanya karbohidrat.
Secara umum, pada Tabel 2 dan Tabel 3 dapat dilihat adanya perbedaan yang tidak nyata pada hasil analisis dengan menggunakan jenis kolom yang berbeda. Perbedaan yang tidak nyata tersebut, dapat terjadi sebagai akibat adanya perbedaan daya pisah masing-masing kolom yang digunakan (Supelco, 1991).
Kolom “Aminex HPX-87H” dalam mendeteksi karbohidrat, hasil analisis selalu mempunyai nilai yang sedikit lebih besar daripada kolom lainnya, walaupun secara statistik, perbedaan hasil tersebut tidak nyata. Hal ini dapat digunakan sebagai bukti bahwa kolom “Aminex HPX-87H” ternyata lebih peka dalam menganalisis senyawa karbohidrat.
Pendapat tersebut diperkuat dengan pendapat Murti (2000), bahwa ternyata deteksi susu fermentasi bifidus dengan menggunakan kolom “Aminex HPX-87H”, mampu mendeteksi dengan peka, terbukti dengan banyaknya puncak grafik yang terdeteksi.
Variabel-variabel lain dalam perangkat kromatografi selain macam kolom, juga dapat berpengaruh pada hasil analisis. Variabel lain tersebut dapat berupa macam fase gerak, suhu kolom, macam fase diam (Biorad, 1998).
KESIMPULAN
Ketiga jenis kolom yang dipakai dalam penelitian, yaitu kolom “Aminex HPX-87H” 4,2 mm x 72 cm, kolom “Waters Microporosyl Carbohydrate”, kolom “CLC ODS”, mampu mendeteksi karbohidrat yakult, yogurt, dan kefir dengan baik. Perbedaan jenis kolom yang dipakai pada penelitian ternyata tidak memberikan pengaruh yang besar pada hasil analisis. Kolom “Aminex HPX-87H” mampu mendeteksi karbohidrat pada ketiga jenis susu fermentasi sedikit lebih peka dibandingkan kolom lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Biorad. 1998. Guide to Aminex HPLC Columns for Food and Beverage, Biotechnology, and Bio-Organic Analysis.
Hadiwiyoto. 1992. Teknik Uji Mutu Susu dan Hasil Olahannya. Liberty. Yogyakarta.
Johnsons, E.L. dan Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Penerbit ITB. Bandung.
Mannheim, Boehringer. 1987. Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis using Test Combination. Boehringer Mannheim GmbH Biochemica. Jerman
Murti, T.W. 2000. Biochemical Changes of Carbohydrates, organic acids, and volaile key compounds of Bifidus Milk. Journal of EAAP 51th Annual meeting Denhaag.
Pirisino, J.F. 1983. High Performance Liquid Chromatographic Determination of Lactose, Glucose, and Galactose in Lactose-Reduced Milk. J. Food Sci. 48:742-743.
Plaga, A., J. Stumpfel and H.P. Fiedler. 1989. Determination of Carbohydrates in Fermentation Processes by Hih Performance Liquid Chromatography. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:45-49.
Satrohamidjojo, Hardjono. 1991. Kromatografi. Penerbit Liberty. Yogyakarta.
Sudarmadji, S., B. Haryono, dan Suhardji. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty. Yogyakarta.
Supelco. 1991. Capillary Selection Guide. Supelco Inc. Perancis.
Toba, T., K.Arihara, dan S.Adachi. 1980. Quantitative Changes in Sugar, Especially Oligosaccharides, During Fermentation and Storage of Yogurt. J. Dairy Sci. 66:17-19.
Toba, T., K.Arihara dan S.Adachi. 1982. Quantitative Changes in Oligosaccarides during Fermentation and Storage of Yogurt Inoculated Simultaneusly with Starter Culture and b-Galactosidase Preparation. J. Dairy Sci. 1240-1245.
Timbang 2 gram susu
Masukkan ke dalam labu ukur 100 ml
Dilusikan dengan 20 ml aquabides + 1 ml TCA 3M
Diamkan selama 10 menit
Netralisiskan dengan 1 M NaOH
Tambahakan aquabides samapi 100 ml
Filter dengan kertas Whatman No. 1
Filter dengan syringe 0,45 mm
Larutan hasil saringan yang jernih untuk diuji dengan menggunakan HPLC
Gambar 1. Langkah kerja persiapan sampel untuk dianalisis dengan menggunakan HPLC (Mannheim, 1987).
Tabel 1. Analisis karbohidrat yakult dengan menggunakan kolom “CLC ODS”, kolom “Waters Microporosyl Carbohydrate”, dan kolom “Aminex HPX 87H”.
| Macam kolom | Komposisi Yakult | ||
| | Laktosa | Glukosa | Galaktosa |
Waters Microporo- | 4,18 | 0,32 | 0,06 |
syl Carbohidrate | 4,10 | 0,28 | 0,04 |
| | 4,09 | 0,30 | 0,05 |
| Rata-rata | 4,12a | 0,30b | 0,05c |
| CLC ODS | 3,99 | 0,29 | 0,02 |
| | 4,00 | 0,28 | 0,04 |
| | 4,00 | 0,28 | 0,05 |
| Rata-rata | 4,00a | 0,28b | 0,04c |
| Aminex HPX 87H | 4,25 | 0,42 | 0,07 |
| | 4,19 | 0,39 | 0,05 |
| | 4,19 | 0,38 | 0,06 |
| Rata-rata | 4,21a | 0,40b | 0,06c |
abcSuperskrip yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan.
Tabel 2. Analisis karbohidrat yogurt dengan menggunakan kolom “CLC ODS”, kolom “Waters Microporosyl Carbohydrate”, dan kolom “Aminex HPX 87H”.
| Macam kolom | Komposisi yogurt | ||
| | Laktosa | Glukosa | Galaktosa |
Waters Microporo- | 3,68 | 0,34 | 0,02 |
syl Carbohidrate | 3,70 | 0,30 | 0,03 |
| | 4,01 | 0,31 | 0,03 |
| Rata-rata | 3,79a | 0,32b | 0,03c |
| CLC ODS | 3,59 | 0,33 | 0,01 |
| | 3,51 | 0,29 | 0,02 |
| | 3,51 | 0,29 | 0,02 |
| Rata-rata | 3,54a | 0,30b | 0,02c |
| Aminex HPX 87H | 3,90 | 0,39 | 0,03 |
| | 4,00 | 0,39 | 0,05 |
| | 4,00 | 0,39 | 0,05 |
| Rata-rata | 3,97a | 0,39b | 0,05c |
abcSuperskrip yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan.
Tabel 3. Analisis karbohidrat Kefir dengan menggunakan kolom “CLC ODS”, kolom “Waters Microporosyl Carbohydrate”, dan kolom “Aminex HPX 87H”.
| Macam kolom | Komposisi Kefir | ||
| | Laktosa | Glukosa | Galaktosa |
Waters Microporo- | 3,88 | 0,44 | 0,10 |
syl Carbohidrate | 3,79 | 0,39 | 0,09 |
| | 4,00 | 0,31 | 0,11 |
| Rata-rata | 4,55a | 0,38b | 0,10c |
| CLC ODS | 3,99 | 0,33 | 0,09 |
| | 4,01 | 0,28 | 0,12 |
| | 4,01 | 0,29 | 0,12 |
| Rata-rata | 4,00a | 0,30b | 0,11c |
| Aminex HPX 87H | 4,00 | 0,39 | 0,11 |
| | 4,00 | 0,39 | 0,09 |
| | 4,09 | 0,38 | 0,09 |
| Rata-rata | 4,03a | 0,39b | 0,10c |
abcSuperskrip yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan.
